Цифровая ПЦР: методы абсолютной количественной оценки с использованием системы QuantStudio™ 3D Di...

Узнайте больше на http://www.lifetechnologies.com/quantstudio3d Измерение абсолютного числа молекул в биологическом образце — относительно распространенная задача, например, определение титра патогенного вируса или количества копий определенной хромосомы или последовательности гена. Однако это может создавать некоторые уникальные проблемы при использовании стандартной ПЦР в реальном времени. ПЦР в реальном времени отслеживает каждый цикл в процессе амплификации, чтобы определить точку, в которой сигнал репортерного красителя превышает заданный порог, так называемый пороговый цикл или Ct. Поскольку амплификация в ПЦР в реальном времени зависит от множества факторов, включая эффективность анализа и показатели калибровки прибора, для преобразования измерений Ct для неизвестного образца в абсолютную концентрацию необходимо сравнение с эталонным образцом известной концентрации. Необходимость наличия эталонного образца поднимает следующие вопросы: Как мне откалибровать эталонный образец в начале? Какова его стабильность? Будет ли достаточно материала для удовлетворения потребностей всех моих исследований? Если у меня недостаточно материала, как мне воссоздать эквивалент? В отличие от стандартных методов, цифровая ПЦР не зависит от пороговых значений циклов. Перед амплификацией образец разделяется на сотни или тысячи независимых повторов реакций, так что не все реакции получают копию интересующей молекулы нуклеиновой кислоты. После стандартной ПЦР-амплификации первым шагом является классификация каждой реакции в зависимости от того, произошла амплификация или нет. Лунки реакции обозначаются как положительные или отрицательные. Сокращение набора данных до положительных или отрицательных значительно снижает зависимость анализа от таких параметров, как эффективность анализа и калибровка прибора. На основе этого первоначального определения положительного/отрицательного результата можно рассчитать абсолютное количество интересующих молекул нуклеиновой кислоты — что наиболее важно, без необходимости сравнения с каким-либо эталонным стандартом. И поскольку эти абсолютные значения не зависят от Ct, данные можно сравнивать на разных приборах и в разных лабораториях. Цифровая ПЦР для абсолютного количественного определения проста. Просто помните о трех простых моментах: вам нужно определить требуемую степень точности измерения. Это определяется общим количеством повторов реакции — чем больше повторов, тем выше достижимая точность. Также это определяется соотношением положительных и отрицательных реакций — очень малое или очень большое количество отрицательных реакций препятствует получению высокоточных данных. Для максимальной точности процент отрицательных реакций должен составлять от 5% до 80%. Далее, поскольку цифровая ПЦР основана на случайном распределении молекул нуклеиновых кислот по тысячам повторов реакции, возможны реакции с участием более чем одной молекулы. Именно поэтому программное обеспечение для цифровой ПЦР должно применять статистику Пуассона — чтобы учесть возможность получения более чем одной молекулы-матрицы в одной реакции. И наконец, как и в стандартной ПЦР, цифровая ПЦР требует ДНК в качестве входной молекулы. При количественном определении РНК обычно сначала преобразуют РНК в кДНК. Поскольку низкая эффективность преобразования снизит общее количество обнаруживаемых молекул кДНК, важно оптимизировать этот этап в процессе количественного определения. Таким образом, когда речь идет об абсолютном количественном определении, цифровая ПЦР представляет собой простой и точный метод для ваших исследований.