Вестерн-блоттинг: принципы работы | Как обнаружить белок

Как вестерн-блоттинг находит один белок среди тысяч — и как понять, что на самом деле означает тёмная полоса? Посмотрите полный рабочий процесс вестерн-блоттинга в этой подробной молекулярной анимации: от лизиса клеток и SDS-PAGE до переноса на мембрану, распознавания антител, обнаружения и анализа полос. Проследите за двумя образцами клеток в ходе эксперимента и узнайте, как разделение по кажущемуся размеру в сочетании с распознаванием антител позволяет выявить целевой белок. Затем выясните, почему контрольные образцы, нормализация и биологические повторы важны, прежде чем делать выводы. В этом анимационном ролике Rethink Biology объясняются следующие моменты: • Экстракция белка и равномерная загрузка • SDS, восстанавливающие агенты и денатурация • Накопление и разделение гелей в SDS-PAGE • Маркеры молекулярной массы и кажущийся размер белка • Перенос на мембраны PVDF или нитроцеллюлозы • Блокирование, промывка, первичные и вторичные антитела • Хемилюминесцентное и флуоресцентное детектирование с помощью HRP • Специфичность антител и экспериментальные контроли • Насыщение детектора, денситометрия и нормализация • Биологические и технические повторы • Дополнительные полосы, размытия и отсутствующие сигналы • Фосфоспецифические вестерн-блоты и их ограничения РАЗДЕЛЫ 00:00 Обнаружение скрытого белка в смеси 00:50 Экстракция белка 01:31 Равномерная загрузка: масса против объема 02:21 SDS, восстановление и денатурация 03:07 Загрузка геля и начало SDS-PAGE 03:57 Разделение белков по кажущемуся размеру Размер 04:48 Перенос белков на мембрану 05:44 Проверка переноса и блокирование 06:28 Первичные и вторичные антитела 07:20 Превращение связывания антител в сигнал 08:01 Контроль и специфичность антител 08:44 Почему более темные полосы могут вводить в заблуждение 09:38 Количественная оценка и нормализация 10:35 Биологические репликаты 11:21 Дополнительные полосы, размытия и отсутствующие сигналы 12:00 Фосфоспецифические вестерн-блоты 12:42 Объединение данных 13:28 Что может рассказать вам вестерн-блот Для студентов и исследователей, изучающих молекулярную биологию, биохимию, биотехнологию и биомедицинские науки. Подпишитесь на Rethink Biology, чтобы получать наглядные молекулярные анимации, связывающие экспериментальные этапы с наукой, лежащей в их основе. #ВестернБлот #ВестернБлоттинг #МолекулярнаяБиология